Univerza na Primorskem, Fakulteta za vede o zdravju

Projektni partnerji:

Vodja projekta:

Prof. dr. Maja Čemažar (SICRIS, ResearchGate)

Povezava:

SICRIS

Izhodišče in predstavitev problema. S povečanim znanjem o človeškem genomu in tehnološkim napredkom na področju molekularne biologije hitro napreduje tudi razvoj genske terapije, vključno z gensko terapijo raka in razvojem DNA cepiv. Eden izmed glavnih ciljev raziskovalcev genske terapije ali DNA cepiv je razvoj varnega in učinkovitega sistema za prenos genov v tarčne celice. To namreč še vedno predstavlja eno od glavnih ovir v razvoju različnih pristopov genske terapije in je ključen dejavnik za uspešnost terapije. Drugi dejavniki, ki jih je potrebno upoštevati pri razvoju genske terapije, so izbira ustreznega terapevtskega gena, regulacija njegovega izražanja in način vnosa. V predlaganem projektu bomo preučevali dva izmed teh dejavnikov. To sta varnost plazmidne DNA s pripravo plazmidne DNA brez rezistence na antibiotik in regulacija izražanja terapevtskega gena s povezavo terapevtskega gena na celične promotorje z namenom doseči gena z indukcijo stresa ali fiziološko regulacijo izražanja. Poleg tega bomo določevali tudi možnost horizontalnega genskega prenosa med rekombinantnimi plazmidi, trangenimi bakterijami in bakterijami naravno prisotnimi v organizmu.
Naša hipoteza je, da so plazmidi, ki kodirajo terapevtske gene pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev ter so brez gena za antibiotično rezistenco, varni vektorji z reguliranim izražanjem za uporabo v genski terapiji
Metode dela. Plazmidi, ki kodirajo za reporterske ali terapevtske protein pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev bodo pripravljeni s standardnimi molekularno biološkimi metodami in po navodilih proizvajalca plazmida ORT. S to tehnologijo bomo proizvedli namreč plazmide brez gena za antibiotično rezistenco. Primerne bakterijske seve bomo transformirali s pripravljenimi plazmidi in proizvedli večje količine plazmidnih DNA brez endotoksina, ki jih bomo uporabili v nadaljnjih poskusih. Horizontalni genski prenos bomo določali s PCR testom in ostalimi standardnimi laboratorijskimi postopki, tudi za pripravo biofilmov.
Učinek pripravljenih plazmidov na delovanje različnih celičnih kultur bom spremljali s testom proliferacije, antiagiogeneze in testom za določevanje metastatskega potenciala.
Na tumorskih modelih in vivo bomo določili protitumorsko delovanje pripravljenih plazmidov, ter opavili histološko analizo tumorjev. Protitumorsko delovanje bomo določali s testom zaostanka v rasti ter testom lokalne kontroli rasti tumorjev.
Izvajanje projekta. Projekt se bo izvajal v laboratorijih pri vseh 5 sodelujočih partnerjih, kjer je za izvajanje eksperimentalnega dela zagotovljena vsa raziskovalna oprema za molekularno biološke tehnike, za celične kulture, za imunocitokemične preiskave in testiranje protitumorskega učinka na tumorskih modelih. Raziskovalci na projektu imajo bogate izkušnje na področju priprave plazmidov, uporabe elektroporacije za vnos različnih molekul v celice in tkiva, kot so citotoksična zdravila in nukleinske kisline, ter radiobiologije.
Vodenje in koordinacija projekta se bo izvajala z neposrednimi kontakti z udeleženci na projektu in rednimi delovnimi sestanki.
Relevanca in potencialni vpliv rezultatov. Predlagan projekt je zasnovan kot predklinični projekt, ki obravnava pomembne teme na področju varne uporabe genske terapije v kliničnih okoljih. Rezultati projekta, če bo uspešen, lahko imajo vpliv na planiranje in izvajanje kliničnih študij genske terapije ne samo v Sloveniji, ampak tudi širše.

Projekt J3-4259 z naslovom “Priprava in validacija terapevtskih plazmidov brez selekcijskega gena za antibiotično rezistenco za gensko terapijo raka z inducibilnimi in tkivno specifičnimi promotorji“ sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz državnega proračuna.